# Expanding the genetic code with phosphotyrosine and phosphothreonine

> **NIH NIH R01** · YALE UNIVERSITY · 2020 · $310,634

## Abstract

Project Summary 
This proposed work seeks to develop a suite of enabling technologies capable of producing synthetic 
phosphoproteins with the goal of transforming the field of human protein signaling from one that is purely 
observation‐based into one that biosynthesizes designer proteins to achieve a comprehensive understanding of 
complex signaling networks. The importance of phosphorylation is emphasized by the fact that 
phosphorylated proteins control most aspects of normal cellular homeostasis.  Aberrations in protein 
phosphorylation can drive cancer, hypertension, diabetes, and neurodegenerative disorders.  Thus, 
understanding differential patterns of protein phosphorylation in disease states is of extreme physiological 
and clinical interest.  Analysis of phosphorylated amino acid residues has been limited by our inability to 
control these chemical modifications due to a lack of phosphomimetics that fully recapitulate the chemistry of 
phosphorylated residues. Current progress toward the elucidation of phospho‐signaling networks is 
hampered by the lack of methods to produce proteins containing specific combinations of phosphorylated 
amino acids. In particular, synthetic chemistry is inadequate for total phosphoprotein synthesis, and 
conventional biological methods do not control phosphorylation levels. We have recently developed a new 
technology, albeit limited to phosphoserine (pSer), that enables the synthesis of recombinant phosphoproteins.  
This technology directs phosphorylated amino acids into their physiologically relevant positions within 
proteins yet our functional understanding of protein phosphorylation will remain incomplete without access 
to phosphotyrosine (pTyr) and phosphothreonine (pThr) containing proteins. Specific Aims: In Aim 1, we will 
utilize mutagenesis and laboratory evolution to engineer an optimized tyrosyl aminoacyl‐tRNA synthetase for 
phosphotyrosine.  In Aim 2, we will provide a solution to this problem by engineering an aminoacyl‐tRNA 
synthetase that can charge a phosphothreonine onto a special tRNA that reads a dedicated open codon. 
Unique to our approach, we will also employ our genomically recoded E. coli cells in which open stop codons 
can be converted into new sense codons that encode pThr and pTyr into precise locations in recombinant 
proteins. Significance: The overall outcome of our studies will be an enabling technology for the expression of 
pTyr and pThr containing proteins that will broadly enable research into disease mechanisms and can be used 
directly to develop new therapies for human disease. This will be the first technology able to re‐create human 
disease networks that are “difficult” or “impossible” to infiltrate, and will establish the paradigm for 
addressing other post‐translational modifications. More broadly, the proposed work will enable the re‐design 
of programmable signaling networks comprising proteins with natural and synthetic nonstandard amino acids 
capabl...

## Key facts

- **NIH application ID:** 9822979
- **Project number:** 5R01GM125951-03
- **Recipient organization:** YALE UNIVERSITY
- **Principal Investigator:** Farren J. Isaacs
- **Activity code:** R01 (R01, R21, SBIR, etc.)
- **Funding institute:** NIH
- **Fiscal year:** 2020
- **Award amount:** $310,634
- **Award type:** 5
- **Project period:** 2017-12-02 → 2021-11-30

## Primary source

NIH RePORTER: https://reporter.nih.gov/project-details/9822979

## Citation

> US National Institutes of Health, RePORTER application 9822979, Expanding the genetic code with phosphotyrosine and phosphothreonine (5R01GM125951-03). Retrieved via AI Analytics 2026-05-23 from https://api.ai-analytics.org/grant/nih/9822979. Licensed CC0.

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*[NIH grants dataset](/datasets/nih-grants) · CC0 1.0*